Tekuća biopsija – mali uzorak, velike informacije

Pacijenti oboljeli od malignih bolesti moraju prolaziti različite postupke kako bi se potvrdila dijagnoza, odredio stupanj opsežnosti i pratila uspješnost njihove terapije. Jedan od takvih postupaka jest biopsija, odnosno postupak uzimanja uzorka tkiva ili stanica iz tijela radi mikroskopske analize. No, prva pomisao na biopsiju izaziva strah i nelagodu kod pacijenata, zbog čega se u novije vrijeme sve više koristi njezina alternativa – tekuća biopsija. Ona je revolucionirala kliničku onkologiju zbog jednostavnosti uzorkovanja tumora, mogućnosti ponavljanih analiza, osmišljavanja terapijskih režima te probira na terapijsku rezistenciju.

Što je tekuća biopsija?

Sve se više govori o konceptu personalizirane medicine u onkologiji, kao inovativan pristup temeljen na mogućnosti sekvenciranja tumora svakog pacijenta. Ona ima za cilj prilagoditi terapiju i pratiti razvitak karcinoma pod određenom terapijom. U tome je biopsija tkiva „zlatni standard“ za dijagnozu i molekularnu karakterizaciju tumora. No, kao takva ima mnoge nedostatke zbog invazivnosti i potencijalnih komplikacija kao što su krvarenja, ozljede, infekcije, boli, količine tkiva i homogenosti uzorka. Zato se tekuća biopsija pokazala kao koristan neinvazivni ponovljivi dijagnostički test, sposobam profilirati molekularnu vrijednost svakog tumora i voditi kliničko liječenje pacijenata oboljelih od raka.

Tekuća biopsija je dijagnostički postupak u kojem se iz uzorka krvi analiziraju cirkulirajuće tumorske stanice ili fragmenti tumorske DNA. Ova metoda može poslužiti za rano otkrivanje raka, ali i za planiranje terapije, procjenu njezine učinkovitosti te praćenje eventualnog povrata bolesti. Prednost tekuće biopsije jest mogućnost učestalog uzimanja uzoraka krvi tijekom vremena, što liječnicima omogućuje praćenje molekularnih promjena u tumoru. Njezina široka i brza primjena u onkološkoj praksi rezultat je razvoja naprednih sveobuhvatnih genomskih profilnih testova te brojnih predkliničkih i kliničkih studija koje su pomogle preciznije definirati njezinu kliničku vrijednost.

Što sve možemo analizirati?

Tumorski mikrookoliš sastoji se od različitih staničnih i nestaničnih komponenti, od kojih mnoge potječu iz samih stanica raka te doprinose njihovu preživljavanju, invazivnosti, metastaziranju i otpornosti na liječenje. Među tim komponentama posebno se izdvajaju CTC-ovi (cirkulirajuće tumorske stanice), ctDNA (cirkulirajuća tumorska DNA), cfDNA (cirkulirajuća slobodna DNA) te izvanstanični vezikule ili egzosomi, koji su se svojim svojstvima pokazali vrijednim biomarkerima prisutnima u perifernoj krvi onkoloških pacijenata. U uzorcima krvi, plazmi, serumu ili u staničnoj frakciji, moguće je detektirati i detaljno karakterizirati različite cirkulirajuće biomarkere.

Biomarkeri relevantni za tekuću biopsiju prisutni su i u drugim tjelesnim tekućinama, što dodatno proširuje koncept tekuće biopsije izvan periferne krvi. Oni se mogu pronaći u prostatičnoj tekućini, urinu (osobito kod raka bubrega, mjehura i prostate), cerebrospinalnoj tekućini (osobito kod tumora i metastaza središnjeg živčanog sustava), slini i sputumu, pleuralnom izljevu (kod raka glave i vrata te pluća), suzama, žuči, peritonealnom ispirku, koštanoj srži (osobito kod raka dojke, prostate i pluća), stolici, majčinom mlijeku te ascitesu.

CTC-ovi, ctDNA, egzosomi

CTC-ovi su stanice raka koje se oslobađaju u krv iz primarnog tumora ili metastatskih mjesta u bilo kojoj fazi tumorogeneze. Prisutne su u cirkulaciji kao pojedinačne stanice ili u klasterima u kojima imaju veću sposobnost metastaziranja. Pokazalo se da se razine CTC-ova mijenjaju izrazito dinamično te mnogo vjernije odražavaju stanje tumora u odnosu na uobičajene krvne biomarkere. Zabilježeno je i da broj CTC-ova predstavlja pouzdan pokazatelj odgovora na terapiju gdje je njihovo smanjenje povezano s boljim ukupnim preživljenjem kod velikog broja pacijenata s rakom dojke. Osim toga, CTC-ovi su pokazali potencijal u ranoj dijagnostici pojedinih vrsta raka, primjerice raka pluća, iako su ti rezultati dobiveni na manjoj skupini pacijenata s kroničnom opstruktivnom plućnom bolešću. Dijagnostička vrijednost potvrđena je i kasnijim nalazima plućnih čvorova te histološkom analizom tkiva.

DNA se oslobađa u fragmentima (cfDNA) putem apoptoze, nekroze i aktivne sekrecije normalnih (posebno limfoidnih i mijeloidnih stanica, zbog česte obnove stanica hematopoetske loze krvi) i stanica raka (ctDNA). Zbog svoje prirode, ctDNA pruža informacije o točkastim mutacijama, varijacijama broja kopija, strukturnim preuređenjima, gubitku heterozigotnosti, genskim fuzijama, promjenama metilacije, integriranim virusnim sekvencama povezanim s tumorom i drugim genomskim potpisima. Studije su pokazale da ctDNA omogućuje mnogo cjelovitiji uvid u obilježja i napredovanje tumora, uključujući promjene koje potječu iz primarnih i metastatskih žarišta. Štoviše, mutacije koje se ne mogu otkriti konvencionalnim uzorkovanjem tkiva mogu se identificirati analizom ctDNA dobivene tekućom biopsijom.

Egzosomi podrijetlom iz tumora male su, okrugle vezikule promjera 30–120 nm, okružene lipidnim dvoslojem i ispunjene proteinima, DNA, RNA, malim nekodirajućim RNA molekulama poput mikroRNA (miRNA) te lipidima. Tumorske stanice ih aktivno oslobađaju i koriste u međustaničnoj komunikaciji između tumora i različitih tipova stanica. Budući da svaka vrsta stanica raka izlučuje specifičan profil egzosoma, oni mogu poslužiti za otkrivanje prisutnosti i tipa tumora. Uz to, njihova visoka koncentracija u raznim biološkim tekućinama dodatno povećava osjetljivost detekcije. Ipak, izostanak jedinstvenih, pouzdanih metoda izolacije i standardiziranih analitičkih postupaka trenutačno predstavlja značajno ograničenje za njihovu širu primjenu u kliničkoj praksi.

Klinički potencijal i izazovi primjene tekuće biopsije

Sadašnja literatura potvrđuje da je tekuća biopsija vrijedan, minimalno invazivni dijagnostički alat koji omogućuje ranu detekciju tumora, praćenje terapijskog odgovora, probir osoba visokog rizika, procjenu tumorske heterogenosti i otkrivanje novih mutacija. Poput klasične biopsije tkiva, pruža detaljne molekularne informacije te može otkriti tumorske promjene mnogo ranije od konvencionalnih testova. Zahvaljujući mogućnosti praćenja intratumorske heterogenosti, ona pomaže u razumijevanju tijeka bolesti i prepoznavanju metastaza, čime potencijalno smanjuje rizik od recidiva. Unatoč prednostima, njezina šira klinička primjena još je ograničena nedostatkom osjetljivosti i specifičnosti, nedovoljno standardiziranim metodama te visokim troškovima. Daljnji tehnološki napredak potreban je za preciznije otkrivanje tumora različitih organa i dublju molekularnu analizu, što će omogućiti potpunije uključivanje tekuće biopsije u kliničku praksu.